一、實驗目的： 
　　1、了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理； 2、掌握測定細菌生理生化反應的技術和方法。 
　　二、實驗原理： 
　　各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。由于細菌特有的單細胞原核生物的特性，這種差異就表現(xiàn)的更加明顯。不同細菌分解、利用糖類、脂肪類和蛋白類物質的能力不同，所以其發(fā)酵的類型和產物也不相同，也就是說，不同微生物具有不同的酶系統(tǒng)。即使在分子生物學技術和手段不斷發(fā)展的今天，細菌的生理生化反應在菌株的分類鑒定中仍有很大作用。 
　　三、實驗條件： 
　　菌種  
　　大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種  
　　培養(yǎng)基  
　　葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）。  
　　試劑  
　　40％NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示劑。  
　　器具 
　　超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。 
　　四、實驗步驟： 
　　(一)    糖類發(fā)酵試驗  
　　1、目的：了解不同細菌分解利用糖的能力及實驗原理，并掌握其操作方法。
　　2、原理：可根據細菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產酸產氣作為鑒定菌種的依據。是否產酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑溴甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經培養(yǎng)后根據指示劑的顏色變化來判斷。是否產氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。 
　　3、材料：菌種：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）的斜面菌種  培養(yǎng)基：葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管  
　　4、流程：  
　　發(fā)酵液試管→標記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄  
　　5、步驟：                        
　　5.1 試管標記：取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標記大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形菌和空白對照。
　　5.2  接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置放入試管中，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結果。  
　　5.3  觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產酸，記錄用“＋”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產酸并產氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內沒有氣泡為陰性反應，記錄用“－”表示。  
　　（二） 乙酰甲基甲醇試驗(V．P試驗)  
　　1、目的：了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操作方法。 
　　2、原理：某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱V．P（+）反應。 
　　3、材料：  
　　3.1 菌種： 大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產氣腸桿菌
　?。‥nterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種  
　　3.2 培養(yǎng)基： 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管  
　　4、流程  
　　培養(yǎng)液試管→標記→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄   
　　5、步驟  
　　5.1  標記試管：取5支裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。